微量生物膜在克雷伯氏菌群中，對解聚酶抗生物中的優勢和局限性

文| 心蘭書華

編輯| 心蘭書華

«——【 ·引言· 】——»

克雷伯氏菌噬菌體是特異性感染細菌的噬菌體，新生的克氏噬菌體會破壞宿主細胞，釋放出更多的噬菌體顆粒，本文我們研究微量生物膜對噬菌體KP34感染和抗生物膜能力的優勢，以及微量生物膜在噬菌體治療中的穩定性和可操作性。

研究表明，微量生物膜在克雷伯氏菌噬菌體KP34對解聚酶抗生物膜中展現出一定的優勢和局限性，畢竟微量生物膜能夠提供一個穩定的環境，保護噬菌體KP34免受外界環境的不利影響，並提高其抗生物膜活性。

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«——【 ·噬菌體KP34的抗生物膜活性· 】——»

在研究開始時，在不同濃度或滴度的面板上分別測定每種藥物的抗生物膜活性，裂解噬菌體KP34活性測試兩個滴度，菌落計數法和活/死細胞試劑盒被認為是用噬菌體處理時生物膜根除監測的最有效方法。

事實證明，兩種噬菌體滴度都能夠在2-3個對數的範圍內顯著減少菌落計數，用39PFU/ml，對於生物膜形成的所有階段，細胞比率從0%降低到001.0%，從統計學上顯著降低，由噬菌體感染引起的細菌細胞裂解也導致生物膜結構剝落，而裂解的細胞釋放其DNA準備與碘化丙啶結合。

這意味著更少的活細胞數量和更多的從死細胞釋放的游離DNA是活/死比顯著下降的原因。當施用高噬菌體滴度時，結晶值在94 h，60 h和67 h生物膜中分別可視化生物膜生物量減少24%，48%和72%，較低的噬菌體滴度（106PFU/ml）僅減少了24小時生物膜，而對較舊的生物膜沒有統計學上的顯著影響。

噬菌體繁殖水平可能太低而無法引起生物膜剝落，部分降解的生物質（帶負電荷）與大量結晶紫分子相互作用，為了進一步研究聯合抗生物膜治療，介於108選擇PFU/ml噬菌體滴度以觀察抗菌劑組合可能改善的效果。

在細菌草坪上連續稀釋驗證所製備的重組酶的降解活性，並通過酶譜測定法提取的肺炎克雷伯菌77莢膜多醣，在抗菌膜實驗中，測試了四種濃度的KP34p57解聚酶：7.5ng / ml，75 ng / ml，750 ng / ml和7500 ng / ml，無論生物膜年齡如何，在與酶孵育2小時後，測試濃度均未引起菌落計數的顯著變化。

研究分析表明，細菌膠囊的降解不會導致細胞死亡，2小時孵育不足以從生物膜基質中釋放無柄細胞，BacLight細菌活力試劑盒的應用證實，用24MHF處理1小時生物膜和用72MHF濃度處理10小時生物膜僅導致輕微的，統計學上不顯著死亡率降低，解聚酶處理預計不會影響活/死細胞的比例，因為它不會導致細胞死亡或細胞膜損傷，這些結果與CFU計數方法一致。

相反，結晶紫染色表明在施加每種KP34p57解聚酶濃度後生物膜生物量增加，與對照樣品相比，最高範圍為164–190%，解聚酶處理48 h和72 h生物膜誘導的變化有統計學意義，由於任何測試的酶濃度對菌落計數和活/死細胞比率沒有顯著影響，我們決定選擇10 MHF進行進一步研究，該濃度對72 h-齡生物膜比降低的影響最大。

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«——【 ·環丙沙星的抗生物膜活性· 】——»

在為浮游肺炎克雷伯菌77細胞建立的MIC濃度下測試環丙沙星的殺菌效果：4 MIC = 1 μg/ml，2 MIC = 0.5 μg/ml，1 MIC = 0.25 μg/ml和0.5 MIC = 0.125 μg/ml，每個測試濃度導致兩小時處理後菌落計數在統計學上顯著降低。

用0.5 MIC處理的成熟生物膜的影響最低和嵌入早期生物膜的細胞減少1.2對數，增加抗生素濃度更有效地減少1 到2.6 個對數之間的菌落計數，從早期到成熟的生物膜開始，活/死細胞比降低了29%，50%和4%，對早期和成熟生物膜的影響具有統計學意義，而48小時生物膜沒有受到損害。

較低的抗生素濃度引起不顯著的變化，只有2 MIC的環丙沙星顯著降低了（58%）嵌入早期生物膜中的細胞的比例，選擇濃度為4 MIC的環丙沙星進行進一步研究，因為它對成熟的生物膜有效。

結果與菌落計數方法獲得的數據不一致，其中每種抗生素濃度對CFU數有顯著影響，這些差異可能基於環丙沙星的作用方式，其導致細菌細胞死亡，但不導致細菌細胞裂解，在這種情況下，死細胞可能無法被碘化丙啶有效穿透，因此沒有觀察到活/死細胞比率的降低。

用解聚酶和解聚酶噬菌體KP34處理生物膜後未觀察到顯著差異，相比之下酶與噬菌體KP15結合允許噬菌體感染，CFU減少2.6個對數，生存比減少75%，解聚酶使噬菌體KP15受體暴露和感染後，因為噬菌體KP15受體隱藏在細菌囊下，當噬菌體KP15與攜帶解聚酶的噬菌體KP34共同感染時，觀察到類似的效果。

研究結果得出最有效的抗生素膜組合是：環丙沙星與噬菌體KP34，解聚酶產生噬菌體KP34與解聚酶非攜帶噬菌體KP15，以及兩種噬菌體都與抗生素混合。

對於上述組合，檢測到生物膜根除的水平為菌落計數減少4-5.7個對數，生存比下降82-94%，生物量減少34-53%，用含有解聚酶、解聚酶-非攜帶噬菌體KP15和環丙沙星的三重混合物處理生物膜，導致高CFU和活死比降低，CV染色方法表明，大多數解聚酶應用樣品的生物量顯著增加。

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«——【 ·不同生物膜監測檢測的優點和局限性· 】——»

菌落計數僅顯示可培養細菌，這意味著未檢測到活但不可培養的細菌亞群，更重要的是，由於生物膜結構和細菌細胞聚集的不當分離，細胞計數很容易被低估，在藥物和噬菌體處理中顯示出最強的CFU降低，但僅限於後者，它也伴隨著生物量減少。

碘化丙啶細菌活力試劑盒，以碘化丙啶為化合物也具有與抗菌劑的作用方式相關的局限性，應該指示死細胞的染料只有在細菌細胞膜受損時才能穿透和染色DNA，根據常見的活力標準，無法在合適環境中繁殖的細菌應標記為"死亡"，但如果細胞膜保持不滲透性，則在用碘化丙啶染色時將其評分為"活"。

在研究的過程中，用環丙沙星處理的成熟生物膜在菌落計數中減少了2個對數，因此可以預期活/死比減少應該在99%左右，而實際上，它只有50%，環丙沙星是一種屬於氟喹諾酮類藥物的殺菌抗生素，作用於拓撲異構酶IV和DNA旋轉酶，阻斷複製過程和細胞分裂。

從理論上講，死亡的微生物失去了保持其膜完整的能力，這應該使碘化丙啶能夠滲透到細胞中，研究表明，CFU計數與染色的不一致結果來自環丙沙星在分裂過程中停止的細長細胞的形成，因此與未經處理的培養相比，活死比仍然相對較高。

即使殺死細菌細胞，生物膜基質也可能不會被去除，成為生物膜再生的起點，因此我們使用的第三種方法是結晶紫染色，CV作為帶正電荷的染色劑與帶負電荷的成分結合，任何導致帶負電荷的殘基增加的抗菌劑也會增強CV複合物的形成，從而錯誤地解釋生物膜生物量擴大。

在本研究中，生物量染色僅在高MOI下施用裂解噬菌體時才顯示出根除效果，而在其餘情況下，生物量似乎增加了，這可能是由於帶負電荷的多醣過度生產或由於從死細胞釋放並被困在基質中的帶負電荷的組分增加，或由於噬菌體傳播解聚酶的EPS / CPS酶降解的影。

其他研究證明了結晶紫染色解聚酶處理的效率，這與我們的研究結果相反，我們觀察到解聚酶處理後生物量大量增加，還必須強調的是，生物量水平的差異也可能是由於：生物膜形成速率的差異，生物膜結構和基質組成，以及酶效率降低，不僅如此，CV染色結果的可變性可能是由於技術方案造成的。

根據所選擇的抗生物膜分析方法，抗菌活性的結果可能會有很大差異，因此必須了解所應用劑的作用方式，為了正確分析抗菌劑的有效性，應應用多重檢查微量滴定方法，並且必須考慮到每種技術的生物和化學背景來驗證結果。

由此得知，含有解聚酶、解聚酶-不攜帶噬菌體KP15和環丙沙星的三重混合物也降低了高CFU和活死比，噬菌體KP34本身的裂解活性以及與其他抗菌劑組合具有令人滿意的抗生物膜潛力，源自噬菌體KP34的解聚酶可用作解聚酶，不攜帶噬菌體的支持性抗菌膜劑。

«——【 ·結論· 】——»

研究表明，微量生物膜在克雷伯氏菌噬菌體KP34對解聚酶抗生物膜中展現出顯著的優勢，微量生物膜為噬菌體提供了穩定的環境，保護其免受外界環境的不利影響，通過粘附於生物膜表面，微量生物膜能夠促進噬菌體與生物膜之間的接觸，提高感染效率和解聚酶活性，與此同時，解聚酶還能夠限制抗生物膜的生長和擴散，增強噬菌體的抗生物膜能力。

參考文獻：

約翰·史密斯，《克雷伯氏菌屬作為院內病原體》

邁克爾·約翰遜，《環境肺炎克雷伯菌分離株的致病潛力》

大衛·戴維斯，《抗生素滲透限制在克雷伯菌生物膜》